测量钙与收缩力的最佳方法(1/3)—样品制备

 

 

 

 

测量钙与收缩力的最佳方法(1/3)

 

使用 Fura-2 测量细胞内钙以及原代心肌细胞和 iPSC-CM 收缩能力的最佳方法。

 

导言
       精确评估心肌细胞中的钙处理和收缩力对于理解心脏生理和发病机制至关重要。要获得可靠的结果，必须正确制备样本并获取准确的数据。本应用说明介绍了利用 IonOptix 系统评估原代心肌细胞和 iPSC-CM 中钙处理和收缩性时，针对这两个方面建议的最佳技术。

 

 

样品制备

 

a. 实验细胞制备

 

原代心肌细胞：

原代心肌细胞的分离应遵循标准方案。

分离原代心肌细胞有两种常用方法： Langendorff 法和非Langendorff 法。

选择哪种方法取决于实验设计和设备的可用性。

 

在获取数据之前，原代心肌细胞最好通过以下三项检查：

• 细胞应具有杆状结构和清晰的肌节
• 强烈建议肌节长度基线值（下面突出显示的区域）高于或等于 1.7μm。
• 细胞不应出现自发收缩

 

iPSC-CM:
在准备 iPSC-CM 进行钙处理和收缩力测量时，确保细胞已正常分化为心肌细胞至关重要。建议将细胞培养至少两周，以便进行适当分化。在此期间，必须定期监测细胞的正常形态和自发跳动活动。

 

形态学：

 

b. 制备 Fura-2 AM 储存溶液

Fura-2 AM 是一种常用的细胞渗透性荧光染料，用于测量细胞内的钙。通常，Fura-2 AM 溶于含有 Pluronic F-127 的溶液中，Pluronic F-127 是一种非离子表面活性剂，用于促进不溶于水的乙酰氧甲基（AM）酯的溶解。不过，在我们推荐的方案中使用的 Fura-2 AM 浓度较低时，就不需要 Pluronic 了。要制备 1 mM 的 Fura-2 AM 储存溶液，在装有 50 g Fura-2 AM 粉末的小瓶中加入 50 LDMSO 50 g Fura-2 AM 粉末的小瓶中，涡旋 1 分钟，直至Fura-2 完全溶解，肉眼观察溶液呈淡黄色。

注意：请务必将储备液等分，以备一次性使用，避免反复冻融循环而影响染料的稳定性。

 

将等分样品保存在 暗处 -20°C

注意：酯键具有高度易变性，遇水会水解。过早水解会导致染料膜不溶。应注意避免将水引入 1 mM Fura-2 AM 储存溶液中。建议使用无水 DMSO 来溶解冻干Fura-2 AM 粉末。还建议在打开储备瓶之前将储备溶液加热至室温，以避免冷凝。

 

c. 给细胞染色 Fura-2

注意：细胞应在实验当天染色。虽然染料会在细胞中去酯化并使细胞膜不透水，但细胞可通过阴离子转运体将去酯化的染料主动转运出细胞。

 

原代心肌细胞：

1. 取 1 毫升细胞悬液置于 Eppendorf 管中，或根据细胞浓度在 Eppendorf 管中的 1 毫升台氏液中滴入几滴细胞悬液。
2. 在 Eppendorf 管中加入溶解的 Fura-2 AM。最终浓度应在 1-2 μM之间.
3. 将 Eppendorf 管倒置几次，混合 Fura 和细胞悬浮液。
4. 用铝箔纸将 Eppendorf 包起来，以防光照。
5. 将试管直立存放在室温下*。
6. 培养 20 分钟后，清洗细胞，停止上样。试管底部应有少量细胞团。取下上清液，加入不含 Fura 的新鲜 台氏液。倒转试管数次，将细胞与溶液混合（轻敲试管底部，使细胞团脱落）。
7. 5 分钟后重复上述步骤。
8.  染色 20 分钟后开始实验是安全的，这样可以为去酯化提供足够的时间。

 

iPSC-CM:

1. 在 HBSS（汉克平衡盐溶液）或台氏液中将 Fura-2 原液稀释至 0.5-1μM 的最终浓度，以制备 Fura-2 AM 的工作溶液。
2. 去除接种 iPSC-CMs 上的培养液。
3. 将 0.5-1 μM Fura 悬浮液加入培养皿或培养孔中。35 毫米培养皿和 24孔培养皿均使用 1 毫升。
4.  在 37°C 孵育15分钟*.
5. 洗涤细胞，停止孵育。建议用台氏液清洗 2 或 3 次。
6. 染色细胞 10 分钟后开始实验是安全的，这样可以为去酯化提供足够的时间。

*注意：最好在室温下染色，以尽量减少染色过程中染料的分隔。成人心肌细胞可以耐受 RT 负荷，但 iPSC-CMs 通常不能。

 

d. 温度控制

原代心肌细胞和 iPSC-CMs 对温度波动高度敏感，因此在整个数据采集过程中保持适当的温度控制至关重要。如果不能保持 37°C 的最佳温度条件，可能会导致细胞行为改变和潜在的实验伪影。

 

使用我们的在线预热器和传统的钙和收缩系统或 MultiCell Lite 系统可以实现温度控制。我们的 MultiCell HTS 具有内置的阶段温度控制，用户可以在IonWizard 中实时监控平板温度。

 

e. 细胞刺激

心肌细胞可通过电或化学方法刺激，这两种方法都应仔细优化。在优化心肌细胞刺激方案时，必须注意 iPSC-CMs 和原代心肌细胞之间可能存在差异。例如，与原代心肌细胞相比，iPSC-CM 通常更小，电特性也不同。因此，这两类细胞的最佳刺激参数可能不同。

在我们的 MyoPacer 电场刺激器上，频率和电压等电刺激参数可轻松调整。有关详细信息，请参阅手册 . 通常，对 iPSC-CMs 的电刺激需要较低的电压和频率，这更适合其较小的体积和较慢的电特性。相比之下，原代心肌细胞可能需要更高的电压和频率才能得到有效刺激。

同样，由于 iPSC-CMs 和原代心肌细胞的细胞行为和对外界刺激的反应不同，化学刺激的最佳药物浓度和时间也可能不同。建议通过剂量反应曲线来优化化学刺激参数，如药物浓度和时间，特别是对于转基因细胞或不常用的药物。

 

为帮助进行实验，建议从以下有关电压、频率和常用药剂的指南开始。不过，关键是要针对每个实验优化这些参数，同时考虑到细胞类型、种类、年龄、培养条件等因素，以及要解决的具体研究问题。

 

 

 

f. 尽量减少背景噪音

背景噪声是数据采集系统光路中光散射和内部反射不可避免的结果。然而，过高的噪声会妨碍数据分析并导致伪影。振动、电气噪声和环境光都可能导致此类噪声。在采集数据时，采取以下措施控制这些因素至关重要：

 

• 将系统置于暗室中（这适用于所有 IonOptix 系统，但 MultiCell HTS 除外，因为它已经是一个封闭的显微镜）。
• 将系统放在防震台或足够坚固的桌子上。
• 如果数据跟踪中出现周期性噪声，请检查附近是否有可能导致电气噪声或过度振动的设备，并重新放置设备或 IonOptix 系统。电气噪声通常出现在主电源（供电线路）上。如果是这样，可能需要使用线路调节器。

 

 

更多内容：

 

测量钙与收缩力的最佳方法(2/3)——数据采集

测量钙与收缩力的最佳方法(3/3)——常见问题