测量 iPSC-CM Ca++ 和收缩性

测量 iPSC-CM Ca++ 和收缩性

用 CytoMotion 测量成熟培养基对 iPSC-CM 钙和收缩能力的影响

源于患者的人类诱导多能干细胞衍生心肌细胞（hiPSC-CMs）作为一种模型系统，在各种应用领域都大有可为^1,2。首先，从（遗传性）心脏疾病患者身上获得的 hiPSC-CMs 可用于评估遗传异常是否与疾病表型有因果关系 ^3,4。其次，这些细胞可用于筛选有效治疗且副作用有限的药物⁵。最后，hiPSC-CMs 是一种用于疾病建模和探索影响心脏疾病的分子机制的有前途的系统 ^4,6。目前测量 hiPSC-CMs 收缩能力的方法仅限于基于视频的分析，这导致数据存储量大、计算速度慢 ^7-9。我们的 CytoMotion Pixel Correlation 对 hiPSC-CMs 进行实时测量不仅速度快，而且能以更高的吞吐量评估收缩力。在这里，我们展示了如何测量 hiPSC-CMs 中的钙和收缩力，以确定成熟培养基的效果。

方法

hiPSC-CM 差异化

如前所述，从健康供体的成纤维细胞中提取的 hiPSCs 被分化为心肌细胞10。简而言之，首先对 iPSCs使用 GSK3 抑制剂，然后使用 Wnt 抑制剂。一旦可以观察到自发跳动的心肌细胞，就根据乳酸代谢对细胞进行代谢筛选（第 11 天）。接下来，一半的 hiPSC-CMs 被置于成熟培养基10 中，另一半在 RPMI 培养基中保留 3 周。

系统设置

使用 CytoCypher MultiCell 高通量系统对 24 孔培养板中自发跳动的 hiPSC-CM 进行了心脏收缩力评估。hiPSC-CM 收缩动力学是在 37°C 温度下进行测量的，测量结果基于CytoMotion Pixel Correlation 相对于以 250Hz 采样频率在舒张期拍摄的参考帧的变化（IonOptix LLC）。在测量收缩力的同时，还通过在细胞中加入 Fura-2、AM 测量钙离子瞬态。每个区域（约100x100um）测量 10 秒钟，可记录 4-10 条收缩迹线。一个区域的全长迹线示例见图 2B 和图 3B。每孔测量了 n=20 个不同区域，每种培养基测量了N=3 孔。我们测量了自发收缩和相同位置对异丙肾上腺素（500nM）的反应。

染色方案

在 hiPSC-CM 中加入钙指示剂 Fura-2，将 Fura-2, AM 溶于二甲基亚砜（DMSO）中，使其达到 1mM 的最终浓度，并将其作为储备液保存在 -20°C 的温度下。将 Fura-2,AM 原液在 1 毫升Tyrode溶液中进一步稀释至 0.5uM 的最终浓度。从培养皿中抽出培养基，换上Tyrode染料混合物。在 37°C 黑暗环境中培养 15 分钟后，移去含有染料的混合液，用温Tyrode溶液洗涤细胞 2 次。

分析

CytoSolver瞬态分析工具包用于得出每个区域的平均收缩和钙动力学参数。在本研究中，我们分析了钙和收缩力的四个关键参数：搏动频率（Hz）、收缩时间或达到峰值的时间（s）、松弛时间或达到基线 50%的时间（s）和 50%峰值宽度（s）。

结果

每个孔的数据收集从开始到结束大约需要 20 分钟（不包括 Fura-2 AM 的孵育时间），并可进行成对统计比较。首先，我们比较了基线参数。一般来说，可以观察到各孔之间的搏动频率、50% 峰值宽度和到基线 50 的时间存在显著差异，但孔内的差异较小（图1、2 和 3）。成熟培养基对搏动频率没有影响，但松弛动力学（至基线 50 的时间）在成熟培养基中显著低于 RPMI 培养基的收缩率，在钙动力学中也几乎显著低于 RPMI 培养基（表 1）。

平均收缩力和钙描记图（图 2B 和 3B）显示了在 RPMI 与成熟培养基中不同的瞬态形状及其对异丙肾上腺素的反应。与 RPMI 培养基相比，成熟培养基中对异丙肾上腺素的反应不同，这表现在成熟培养基中的搏动频率显著增加（图 1）。

图1: **在异丙肾上腺素（ISO）作用下，成熟培养基会导致搏动频率增加**。
在 RPMI 培养基中没有观察到搏动频率的变化，而在成熟培养基中 500nM ISO 后搏动频率显著增加。每种颜色代表一孔（N=3），小圆点表示每孔的单个区域（n=20），大圆点表示每孔的平均值。ISO 前后相同区域的测量结果用线连接。

在 RPMI 培养基中，对 ISO 反应的收缩动力学更快（图 2C），而在 RPMI 和成熟培养基中，松弛动力学不受 ISO 的影响（图 2D）。在 RPMI 培养基中，峰宽对 ISO 的反应较小（图 2E）。在 RPMI 和成熟培养基中，钙动力学对 ISO 的反应速度更快（图3C 和 3D），这导致两种培养基中的峰宽对 ISO 的反应速度大幅减小（图 3E）。

图 2: **在 RPMI 培养基中使用异丙肾上腺素（ISO）后收缩动力学增强。**
(A-B)一个区域（成熟培养基）的收缩力轨迹示例以及 ISO前后 RPMI 和成熟培养基中的平均收缩力轨迹。(C）在 RPMI 培养基中，收缩动力学（达到峰值的时间）对 ISO 的反应略有降低。(D) 在 RPMI 和成熟培养基中，松弛动力学（至基线 50%的时间）未受 ISO 的影响。(E) 在RPMI 培养基中，50% 峰值宽度对 ISO 的反应明显减小。每种颜色代表一孔（N=3），小点表示每孔的单个区域（n=20），大点表示每孔的平均值。ISO 前后相同区域的测量结果用线连接。

图3: **异丙肾上腺素 (ISO) 作用后钙动力学增加。**
(A-B)一个区域（成熟培养基）的钙痕量示例以及 ISO 前后 RPMI 和成熟培养基中的平均钙痕量。(C) 在成熟培养基中，达到峰值的时间因 ISO而略有缩短。(D) 在 RPMI 和成熟培养基中，弛豫动力学（至基线 50%的时间）在 ISO 的作用下均缩短。(E）在 RPMI 和成熟培养基中，50% 峰值宽度对 ISO的反应明显减小。每种颜色代表一孔（N=3），小点表示每孔的单个区（n=20），大点表示每孔的平均值。ISO 前后相同区域的测量结果用线连接。

总结

我们的研究表明，在 hiPSC-CMs 中同时测量钙离子和收缩力是可行的，而且通量相对较高。在这些制备物中进行 240 次测量总共需要 2 个小时。我们利用测量一个孔的时间将 Fura-2 装入另一个孔，从而最大限度地减少了等待时间。在相同位置重复测量的能力大大提高了我们的统计能力。各孔之间存在差异，但各孔对 ISO 的反应相当（图 2和图 3）。

成熟主要改善了钙的再摄取和松弛动力学，Feyen 等人曾对此进行过描述 10。搏动频率在 RPMI 培养基中对 ISO 的反应没有变化，但与成熟培养基相比，RPMI 培养基中钙和收缩动力学的变化更大。

总之，CytoMotion Pixel Correlation 与 Fura-2 钙测量相结合揭示了 RPMI 与成熟培养基之间的显著差异及其对异丙肾上腺素的反应。

Acknowledgements

We sincerely thank Li-Yen Wong for supplying us with hiPSC-CMs.

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